2019年10月28日 讯 /生物谷BIOON/ --近日，一项刊登在国际杂志The New England Journal of Medicine上的研究报告中，来自北京大学-清华大学生命科学联合中心邓宏魁研究组、解放军总医院第五医学中心陈虎研究组及首都医科大学附属北京佑安医院吴昊研究组的研究人员通过联合研究发表了题为“CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia”（利用CRISPR基因编辑的成体造血干细胞在患有艾滋病合并急性淋巴细胞白血病患者中的长期重建）的研究论文，这项研究成果标志着世界上首例通过基因编辑干细胞治疗艾滋病和白血病患者的案例由我国科学家成功完成了！

CCR5修饰的HSPCs的移植

图片来源：Lei Xu et al. N Engl J Med 2019 DOI：10.1056/NEJMoa1817426

我们都知道，如今CRISPR-Cas9基因编辑工具对哺乳动物细胞的基因组进行编辑已经被广泛使用了，该技术展现出了潜在的临床使用前途，而且目前研究人员已经开始利用该技术来探寻基于CRISPR的疗法治疗人类疾病的安全性和可行性。CCR5是HIV-1感染人体的一个保护性靶点，CCR5缺失的血细胞常常对HIV-1的感染有很大的抵抗力；有研究表明，当将携带天然CCR5突变的造血干细胞和祖细胞（HSPCs，hematopoietic stem and progenitor cells，造血干祖细胞）进行同种异体移植后（allogeneic transplantation）就能长期根除HIV-1，因为CCR5是HIV进入机体的关键共受体，这些事例或许就增加了一种可能性，即移植携带人工破坏CCR5的细胞或能作为一种新方法来制造对HIV-1感染耐受的细胞。

此前研究中，研究人员建立了一种无病毒的CRISPR基因编辑系统，其能产生CCR5被破坏的人类HSPCs，效率能达到27%；在动物模型中，这些CCR5修饰的HSPCs能产生一种对HIV-1感染耐受的强大免疫系统；这项研究中，研究人员将CRISPR编辑的CCR5被剔除的造血干祖细胞（HSPCs）移植到HIV-1感染且患有急性淋巴细胞白血病（ALL）的患者中，研究者发现，患者的ALL能够得到完全缓解（完全供体嵌合），而且携带CCR5被剔除的供体细胞能在患者体内存活长达19个月以上，同时患者并未出现于基因编辑相关的不良反应。在患者抗逆转录病毒治疗中断期间，携带CCR5被剔除的CD4+ T细胞的比例略有增加，尽管研究人员实现了CRISPR编辑的HSPCs的成功和长期移植，但淋巴细胞中CCR5被破坏的比例仅有5%左右，这还需要研究人员后期进一步深入研究。

2017年邓宏魁课题组对该技术体系进行了优化，同时致力于该技术的临床应用，目前已经通过原解放军第307医院伦理委员会审批，在ClinicalTrials.gov网站上进行了临床研究注册(NCT03164135)。这项研究中的患者分别在2016年5月14和5月16倍诊断为HIV-AIDS和ALL（T细胞型），患者体内病毒载量为8.5*106拷贝/毫升，CD4+ 细胞计数结果为528*106/升，患者随机使用抗逆转录病毒药物进行治疗，即每天300 mg拉米夫定、300 mg的替诺福韦、每天两次洛匹那韦-利托那韦（400mg洛匹那韦和100mg利托那韦），治疗1年后患者体内的HIV-1感染能得到有效控制，且血清中检测不到病毒RNA的存在（即小于40拷贝/毫升）；患者同时还接受了6个疗程的ALL标准化疗，化疗使得患者的症状得到了完全缓解，通过流式细胞技术进行检测后，患者在化疗第5个第6个疗程之前的微小残留病（minimal residual disease）分别为3.10%和0.04%，6个疗程后微小残留病检测不到了（小于0.01%）。供体为一名33岁来自中国骨髓捐献计划中的男性捐献者，其携带有未突变的CCCR5基因，其与受体具有完全匹配的HLA（组织相容性抗原），2017年9月。患者接受了异体造血干祖细胞移植。

这项研究中，研究人员报道了利用CRISPR-Cas9基因编辑的CCR5突变的HSPCs成功对感染HIV-1合并ALL的患者进行同种异体移植的案例，供体细胞完全嵌合，移植HSPCs后患者的ALL在19个月内能够保持完全缓解的状态，在此期间，经过修饰的CCR5基因能够持续存在，在骨髓细胞中CCR5突变的范围为5.20%-8.28%，研究结果证明了研究者能够实现CRISPR编辑的同种异体HSPCs的长期移植，然而移植后受体的反应效率或许还不足以达到治愈HIV-1感染的目标。

在研究者19个月的随访观察中，他们发现，CRISPR介导的CCR5剔除效率在骨髓样本中为5.20%-8.28%，同时研究者在多个造血谱系细胞中观察到了CRISPR介导的CCR5剔除的状况，这就表明CCR5剔除/突变的HSPCs能长期移植到患者机体中并发挥相应的作用。尤其是，患者机体中的CD4+ T细胞和CCR5突变体能够持续产生并不断释放到患者的外周血中，而外周血中的CD4+ T细胞的数量也会在患者移植后6个月内逐渐恢复到正常水平，同时患者接受HIV-1感染的治疗还能为其提供机会性的保护。

本文研究的重要一点在于研究者能够评估CRISPR-Cas9介导的基因疗法的临床安全性，此前基于HSPC的基因疗法并没有那么有效，原因在于外源性DNA会随机整合到宿主基因组中，有时候甚至会引发急性免疫反应或肿瘤的发生。这项研究中，研究者通过非病毒转染的方式来引入Cas9核糖核蛋白，从而就能有效避免外源性DNA的引入及Cas9在靶细胞中的长期存在，这或许就是导致意外脱靶突变的潜在因素。利用高通量全基因组测序的方法，研究人员分析了患者移植前的样品和移植后15周、12个月及19个月的样品，结果并未检测到任何单核苷酸的突变、大型片段的缺失及与CRISPR修饰相关的染色体重排等；此外，研究者也并未观察到与基因编辑相关的负面事件。基因编辑和脱靶效应所带来的临床不良事件往往能为基因编辑方法的安全性提供初步支持，然而，目前低效率靶向作用CCR5或许限制了脱靶基因编辑分析的深度；因此，研究人员有必要在更高的基因靶向作用下，进一步分析CRISPR-Cas9介导的HSPCs中CCR5突变的安全性和效率。

在患者移植HSPCs后7个月中断了抗逆转录病毒治疗，在中断两周后研究者观察到患者机体中CCR5缺失的比率有所增加；在患者机体基因编辑效率降低可能是因为CD34缺失的细胞中共融合HSPCs的竞争性移植以及供体T细胞的持久性，为了进一步阐明CCR5突变的HSPCs抵御HIV-1的效率，研究人员非常有必要增加CRISPR-Cas9基因编辑系统的效率以及改善移植方案。

最近有研究表明，CCR5-Δ32突变的纯合性往往与患者的预期寿命下降有关，这或许就凸显了CCR5突变在个体水平下的潜在有害效应；然而，与控制HIV感染的其它基因编辑策略不同的是，HIV感染患者机体造血系统中CCR5的剔除/突变并不会改变非造血组织中基因的表达。

总而言之，中国科学家的这项最新研究描述了同种异体干细胞移植后CCR5 CRISPR基因编辑的CD34+细胞的长期移植状况，其对循环骨髓细胞基因组的基因干扰比率不到8%，而且并不存在基因编辑的脱靶效应。这项长达多年的工作目前已经初步证实了基因编辑造血干细胞在临床应用中的可行性与安全性，未来将会促进和推动该技术的临床应用。未来研究人员将会继续深入研究通过各种方法来优化基因编辑造血干细胞移植方案，从而降低脱靶率，实现100%的CCR5的敲除效率。（生物谷Bioon.com）

参考资料：

Lei Xu， M.D.， Ph.D.， Jun Wang， M.D.， Ph.D.， Yulin Liu， B.S.， et al. CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia， N Engl J Med 2019； 381：1240-1247 doi：10.1056/NEJMoa1817426

近日，一项刊登在国际杂志Nature Genetics上的研究报告中，来自美国Dana-Farber癌症研究所等机构的研究人员通过对一组极易患癌的家庭进行研究的过程中鉴别出了一种罕见的遗传性基因突变，其或会明显增加个体在一生中患胰腺癌和其它癌症的风险。识别出这种此前未知的突变或能帮助研究人员对这种较强胰腺癌家族史的个体进行常规检测，从而确定其是否携带有这种突变（RABL3基因），如果确定是的话，研究人员或许就能在疾病早期对患者进行筛查。

目前有研究证据表明，通过筛查高风险个体来发现胰腺癌或能改善患者的预后，此外，患者的亲属也能够选择进行检测来排除其机体是否也携带有RABL3基因突变。大约10%的胰腺癌都有一定的家族模式，尽管目前研究人员鉴别出了一部分基因突变，然而在大多数情况下，致病性的基因缺陷并不为人所知，一种促进个体易患胰腺癌的遗传性突变就会发生在BRCA2上，该基因会引发某些乳腺癌和卵巢癌。研究者所鉴别出的RABL3基因的突变会增加个体在其一生中患癌的风险。

研究者表示，因为疗法有限，胰腺癌让研究人员非常头疼，而家族性的胰腺癌又是一种遗传性基因突变引发一个家族内多个病例的疾病，深入研究家族性胰腺癌或有望帮助研究人员开发出新型预防性策略和疗法。相比促进细胞恶性病变的体细胞基因突变而言，RABL3是一种癌症易感基因突变，个体出生时就会携带该基因突变，而且突变还会增加个体在一生中患癌症的风险；尤其是，RABL3突变会加速细胞内已知胰腺癌蛋白KRAS的运动，这种改变会促进KRAS在细胞膜中的布局，并诱发一系列促进细胞癌变生长的事件发生。

由于KRAS的活性会在大部分胰腺癌中发生改变，因此持续研究RABL3突变对KRAS活性的影响或许能够帮助研究人员阐明胰腺癌发生的机制并开发出新型靶向性疗法。研究者强调，RABL3突变在一般人群中非常罕见，但对其进行检测（RABL3的其它突变）或能揭示其他未解决的遗传性癌症综合征家族人群的遗传倾向。在家族人群中鉴别出特殊突变或能帮助指导其亲属进行相应的胰腺癌筛查。

最后研究者Nissim表示，尽管目前并没有针对这种特定基因突变的测试手段，但后期研究人员将会开发出针对这种基因突变的测试技术；而且针对该突变进行检测将会被推荐给有较强胰腺癌风险家族史的人群中。

原始出处：

Sahar Nissim, Ignaty Leshchiner, Joseph D. Mancias, et al.Mutations in RABL3 alter KRAS prenylation and are associated with hereditary pancreatic cancer,Nature Genetics(2019). DOI:10.1038/s41588-019-0475-y

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腔面型乳腺癌的抗雌激素内分泌治疗，HER2阳性乳腺癌的抗HER2靶向治疗，而三阴性乳腺癌（TNBC）（ER-、PR-、HER2-）作为其中“高段位”选手，仍然缺乏明确的治疗靶点，三阴性乳腺癌的治疗依旧是世界性的医学难题。

近年来，科研人员一直致力于三阴性乳腺癌的靶向治疗，满路荆棘却从未放弃，近日科学家们终于在基因编辑领域看到了治疗三阴性乳腺癌的新曙光，利用靶向性CRISPR基因编辑系统可成功阻止TNBC肿瘤在体内的生长，安全无害，为三阴性乳腺癌的治疗开辟了新格局。

提及乳腺癌基因，首当其冲的自然是明星基因HER2及BRCA1/2了，殊不知，在三阴性乳腺癌中，一种名为Lipocalin2的基因才是真正的王者，小分子脂质运载蛋白Lipocalin-2（LCN2），作为HIC1(三阴性乳腺癌的肿瘤抑制因子)直接调控的下游靶基因，在介导乳腺癌的侵袭转移过程中发挥了重要作用。

在乳腺癌术前患者血清中，LNC2在三阴性乳腺癌中呈现出了高分泌状态。如此看来，分泌型小分子蛋白LCN2可能是通过NGALR受体活化了下游AKT信号通路，从而促进了乳腺癌的侵袭转移。而HIC1-LCN2轴可作为一个特异性的分子亚型预后标志物，为三阴乳腺癌治疗提供了一个有吸引力的候选目标。

LCN2促进乳腺癌细胞生长

靶点有了，如何delete掉呢？研究人员想到了CRISPR系统，不可否认，自问世以来，CRISPR的成功是一发不可收拾的，距开始利用CRISPR/Cas进行基因编辑不到一年时间里，人们就实现了用该系统来校正遗传疾病，从基础生物学研究领域到植物育种、新药研发等应用领域，已有广泛的应用。

然而，由于缺乏有效的CRISPR传递系统，其在癌症治疗领域，一直表现平平。

通过不断地探索，人们发现了两种提高CRISRP递送效率的方法:一种以病毒为载体来传递，而该方法因载体容量及显著的毒副作用而受到限制，另一种便是将CRISPR系统封装在阳离子聚合物或脂质纳米粒中来进行递送。

在本次研究中，波士顿儿童医院的研究人员选择了后者并加以改善，将CRISPR编辑系统封装在由无毒脂肪分子和水凝胶组成的软“纳米凝胶”中，将抗体附着在凝胶表面，通过识别和定位ICAM-1(三阴乳腺癌的药物靶点)，来引导CRISPR纳米粒子抵达肿瘤细胞所处位置。

软“纳米凝胶”更有攻击力及穿透性，当较硬的纳米粒子被机体正常细胞捕获时，软粒子便与肿瘤细胞膜融合，直接在细胞内传送CRISPR有效载荷。而一旦进入细胞内，CRISPR系统就会破坏并敲除Lipocalin2。

在本次研究中，改良版CRISPR基因编辑系统的递送成功率高达81%，进一步在小鼠模型中进行实验，则成功阻止了77%三阴性乳腺癌小鼠的肿瘤细胞生长。

实验表明，癌基因的丢失抑制了肿瘤细胞的侵袭性行为，不仅如此，被注入由软纳米凝胶包裹的CRISPR编辑系统的三阴性乳腺癌小鼠未表现出明显的不适，进一步印证了改良版的安全无害作用，推动了药物研发进程！

这项研究打破了三阴性乳腺癌靶向治疗僵局，为三阴性乳腺癌的治疗提供了理论基础。未来研究中研究人员还将继续深入动物实验研究，以尽快将改良CRISPR系统推进临床。

参考文献

Peng Guo, Jiang Yang, Jing Huang, Therapeutic genome editing of triple-negative breast tumors using a noncationic and deformable nanolipogel.

波士顿2019年8月19日 /美通社/ -- 主要关注新兴技术的市场情报和活动公司 IDTechEx 报告说，到2029年，3D打印医疗器械和药品市场产值将会达到61亿美元。IDTechEx 发现这将会是一个快速成长的市场，某些子市场的复合年增长率最高可达18%。

正如 IDTechEx之前所报告的那样，3D 打印正在颠覆我们提供个性化医疗的方式。IDTechEx 将助听器行业描述为一个已经被3D 打印技术改变的行业 -- 3D 打印所能带来的数字化精密度能够在提升病人舒适度的同时缩短产品制造时间。在这篇文章中，我们主要是讨论关于3D 打印如何能够颠覆医疗器械行业的更多例子。

3D 打印创造隐形牙套

牙科领域的3D 打印就是这样的一个高成长市场，由3D 打印所制造的最为著名的一款牙科产品之一，是 Invisalign（隐适美）透明正畸矫正器。这些器械由 Align Technology（爱齐公司）利用3D Systems 的 ProX SLA 打印机进行制造。Invisalign 产品采用造型美观的设计，尤其是对希望最大限度地遮挡正畸矫治器的成年病人而言。此外，作为一款可移动的器械，病人在吃东西上面毫无困难，口腔卫生问题也能得到简化。虽然这些器械可能不适合支持治疗每位病人，但是它们却已经被用来治疗全球近600万病人。许多竞争者现在开始寻求从这个不断扩大的大市场中获取利润。

3D打印支持生长发育中的儿童接受实惠的修复手术

一项振奋人心的新兴运动是利用3D打印为儿童开展实惠的修复手术。传统的修复手术的价格在5000美元至50,000美元之间，给家长们带来了在财务上难以克服的挑战，而孩子们每隔几个月就要接受一场新的修复手术。像 e-NABLE 这样的慈善组织现在利用3D打印，从开源设计中创造手部和手臂，帮助减轻全球家长在财务上面的负担。修复手术不仅能够在价格上予以承受，与传统修复手术的冗长定制化流程相比，3D 打印从订货到交货的时间也有所缩短。虽然这项应用对整体市场产值贡献有限，但是如今在修复手术领域还有很大的需求尚未被满足，而3D 技术能够为此带来解决方法。

近年来，肿瘤免疫治疗已经成为癌症治疗的重要方法之一，其中典型代表就是靶向于免疫检查点程序性细胞死亡-1（PD-1）和PD-L1的单抗，如PD-1单抗Opdivo和Keytruda，以及PD-L1药物Tecentriq、Bavencio和Imfimzi。

然而，PD-1/PD-L1疗法在绝大多数实体瘤中通常只有10~20%的有效率。因此，对现有的PD-1/PD-L1疗法进行改进，以增加患者的缓解率和生存率成了亟待解决的问题。

M7824是德国默克公司开发的用于治疗晚期癌症的创新型融合蛋白单抗，可阻断癌细胞的两种常用的信号传导途径：TGF-β和PD-L1，被人们称之为升级版的PD-1/PD-L1抑制剂。

TGF-β通路的重要性

人类转化生长因子β（TGF-β）在肿瘤中具有多种功能。在癌症发展的早期，TGF-β能够阻止肿瘤细胞的增殖，并促使其分化和凋亡。然而，当肿瘤进展时，由于TGF-β受体表达的丧失或对下调信号因子的突变，肿瘤TGF-β的不敏感性增加。随后TGF-β通过其血管生成，诱导上皮细胞-间充质转化（EMT）和免疫抑制作用，促进肿瘤的进展。

M7824是由上市的PD-L1抑制剂Avelumab通过Linker融合TGF-βRII组成，一端能够识别并结合PD-L1，另一端则是用于捕获TGF-β。正因为如此，M7824能够同时阻断PD-1/PD-L1通路及TGF-β通路从而促进免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用（M7824结构如下图所示）。

M7824结构图

非小细胞肺癌：有效率最高达71.4%

研究共招募80例没有用过PD-1抑制剂的晚期非小细胞肺癌患者，其中40例使用500mg剂量，另外40例使用1200mg剂量，2周一次。

在1200mg剂量组的40例患者中，M7824的有效率明显高于PD-1的历史数据，显示出了"升级版PD-1"的潜力：

1. 在所有40例患者中，M7824的有效率高达27.5%，而PD-1一般只有18%；

2. 在PD-L1阳性患者中，M7824的有效率高达40.7%，而PD-1一般只有18-27%；

3. 在PD-L1高表达患者中，M7824的有效率高达71.4%，而PD-1一般只有29-44%。

M7824对多种实体瘤有效

M7824在针对宫颈癌、胰 腺癌、类癌等侵袭性实体肿瘤中的I期临床试验也取得了较好的治疗效果(NCT02517398)。19名晚期实体瘤患者接受了不同剂量水平的M7824治疗，直至病情进展或不可耐受的毒副反应。结果如下图所示：

试验结果表明M7824在所有剂量水平中均有疗效：

1例宫颈癌患者(HPV感染阳性)达获得完全缓解(M7824，10mg/kg)，由于不良反应，患者在第10.5个月时停药，但临床上仍表现为持续缓解；

1例具有微卫星错配修复缺陷的胰腺癌患者，在第4.5个月获得部分缓解(影像学观察到的病灶缩小30%以上)，肿瘤标志物表现持续下降，第10.5个月出现病情进展(M7824，3mg/kg)；

1例发生肝转移的HPV阳性的肛门癌患者，获得部分缓解(M7824，0.3-10mg/kg)；

1例HPV感染状态未知的宫颈癌患者，获得部分缓解(M7824，20mg/kg)。

M7824联合放化疗的效果

Yan Lan研究团队为扩大M7824的市场应用价值，对M7824进行了与放疗或者化疗联合治疗的实验，实验结果证明M7824能够显著提高放疗及化疗疗效，抑制肿瘤的生长，并促进炎症因子的释放。

M7824与放化疗联合用药

案例分享：治疗宫颈癌达到完全缓解CR

49岁HPV感染阳性的女性转移性宫颈癌患者，在接受顺铂/紫杉醇后加贝伐单抗治疗，随后病情进展，出现两个病理性扩大的纵隔淋巴结（图A左侧箭头）。入组M7824的临床试验后，在用药7.5个月后奇迹出现，CT扫描显示达到完全缓解，10.5个月时由于胃轻瘫而停止治疗，在13个月的再次扫描仍未发现病灶，证明反应是持久的（图A的右侧）。用药后CEA（肿瘤标志物）持续下降(图B)！

宫颈癌患者使用M7824后，CEA持续下降

M7824是德国默克的在研新药，能够同时靶向PD-1/PD-L1及TGF-β免疫抑制通路，表现出了强大的抗肿瘤活性，并且其药效优于PD-L1或TGF-β抑制剂单独用药。因为具有这些令人惊喜的临床数据，M7824早已进入了临床开发阶段，并且通过了安全性及剂量递增的早期研究。2018年12月，美国食品和药物管理局（FDA）已授予M7824治疗胆管癌（BTC）的孤儿药资格。相信在不久的将来，M7824能够续写PD-1抑制剂的传奇。

参考文献：

1. Lan Y, Zhang D, Xu C, et al. Enhanced preclinicalantitumor activity of M7824, a bifunctional fusion protein simultaneously targeting PD-L1 and TGF-β. Science translational medicine, 2018,10(424): eaan5488.

2. http://clincancerres.aacrjournals.org/content/24/6/1287.

由辛辛那提大学和日本庆应大学、广岛大学的研究人员组成的国际研究团队发现了癌细胞的能量产生机制，这种机制会驱动核仁的生长，使肿瘤迅速繁殖。

这一研究发现公布在8月1日的Nature Cell Biology杂志上，这将促使新的癌症治疗方法的发展，通过减少核仁的能量来阻止肿瘤生长。

“核仁是癌症风暴的‘眼睛’，它会摧毁患者的身体。能够控制‘眼睛’将成为治疗癌症的真正改变者，”文章作者之一，加州大学医学院副教授Atsuo Sasaki博士说。

加州大学医学院副教授Atsuo Sasaki博士（图片来自Colleen Kelley）

早在100多年前，科学家们就发现癌细胞中核仁会增大，位于细胞核中心附近的核仁能产生核糖体，研究表明核仁增大导致核糖体显著增加，推动蛋白质合成，从而大规模生产癌细胞。但是确切地说，核仁如何在癌细胞中产生大量的核糖体，这在很大程度上仍然是一个谜。

“核仁增大是癌症的一个标志，它的大小长期以来一直被用来衡量癌症患者的晚期程度，”Sasaki说，“现在，我们的研究团队发现核仁是通过吞噬三磷酸鸟苷（GTP）迅速扩大，后者是一种核苷酸，也是产生RNA的必需构件之一，这在癌细胞中很常见。”

“我们惊讶地发现，在可用于细胞生长的所有类型的能量中，GTP在核糖体增加中起着最重要的作用，与癌细胞中的核仁增大有关”，Sasaki补充道，这是一项重大发现，通过大量的专业知识可以了解它的真正含义。

Sasaki说，研究人员发现癌细胞中肌苷一磷酸脱氢酶（IMPDH）水平升高，加速了GTP的产生，从而促进了核仁的生长。他说，这是解决围绕癌细胞核仁生长之谜的重要一步。

为了进行这项研究，多学科团队在动物模型中研究了恶性脑瘤和胶质母细胞瘤（最致命的脑癌）的能量产生途径，然后对人体样本进行了群组研究。结果显示在胶质母细胞瘤中GTP这种能量形式显著增加。他们对脑肿瘤细胞进行了深入研究，确定了癌细胞中IMPDH水平显著升高可加速GTP的产生。

这项研究发现了IMPDH与细胞核之间的密切关系，由此，Sasaki的团队开发出一种新的代谢分析方法，使研究人员能够获得关键数据，证明IMPDH活性产生的GTP用于核仁的核糖体合成，同时这项研究也发现抑制胶质母细胞瘤细胞生长和IMPDH抑制之间的明确相关性，这延长了动物模型的寿命。

“通过我们的跨国跨学科合作和团队的辛勤工作，解开了癌细胞劫持GTP代谢，控制核仁的机制。之后我们还将继续研究GTP用于治疗患者‘癌症之眼’的疗效。”

前言：总部位于美国佛罗里达州的Breckenridge Pharmaceutical Inc.公司于当地时间2018年10月5日发布消息称，FDA日前正式批准了该公司申报的COPD治疗药物罗氟司特的ANDA，从而使该公司成为继Torrent Pharms Ltd之后第二家获得FDA批准的罗氟司特仿制药生产商。

1 罗氟司特的历史（摘自Thomson Reuters Integry）

罗氟司特是一种磷酸二酯酶Ⅳ抑制剂，最早于2010年获EMA批准作为支气管扩张治疗的添加疗法，用于有过频繁发作史的成年慢性支气管炎患者的重度COPD的维持治疗。欧洲地区，罗氟司特有多个商品名，包括Daxas、Libertek与Daliresp，并率先于2010年在德国上市，随后不久即在英国上市。在根据FDA的要求补充了相关信息与数据分析之后，罗氟司特于2011年3月获FDA批准，并于当年6月在美国上市。此前，罗氟司特也进行过治疗特异性皮炎与银屑病的早期临床试验，但均无进一步的进展。2005年，Altana公司（后于2007年被Nycomed收购）在与EMA进行磋商后，撤回了罗氟司特用于治疗上述适应证的MAA。

2002年，田边制药株式会社（现在的三菱田边制药株式会社）获得了日本地区罗氟司特的开发权，然而这一授权于2011年宣告终止。2009年，Nycomed与原先的Forest Laboratories就美国地区罗氟司特的销售达成合作协议。2010年，Nycomed与默克公司达成协议在加拿大与欧洲（法国、德国、意大利、西班牙与葡萄牙）共同推广罗氟司特用于治疗COPD，此外，根据该协议，罗氟司特在英国由Merck公司独家销售。但双方随后于2011年终止了上述协议。2011年，Nycomed将罗氟司特在西班牙地区用于治疗重症COPD的销售权转让给了Almiral公司。2011年9月，日本武田制药收购Nycomed，从而将罗氟司特收入旗下。

2015年，先前收购了Forest Laboratories的Allergan公司将罗氟司特在美国与加拿大地区的开发与销售权剥离给了阿斯利康公司。2016年5月，阿斯利康还通过收购武田制药的呼吸系统药品业务而获得了其他国家或地区罗氟司特的相关权利。

2 罗氟司特的市场表现

根据IMS数据库的信息，罗氟司特上市后历年的全球销售额如图1所示。

图1 罗氟司特的历年全球销售额

罗氟司特刚获批上市时，曾经因为是首个口服的COPD治疗药而被寄予了成为重磅炸弹的希望，然而从图1可以看出其上市后的市场表现却有点令人失望。笔者认为，导致罗氟司特市场表现平平的原因除了原研方Nycomed及其合作方不稳定的合作关系，各方薄弱的销售能力（只有默克公司与阿斯利康是实力雄厚的大公司，而与默克的合作关系只维持了一年），COPD领域的霸主与黄金标准药物噻托溴铵以及其他吸入剂型的药物对罗氟司特的市场扩展构筑了巨大的竞争压力。根据IMS数据，噻托溴铵历年的全球销售额如图2所示。

图2 噻托溴铵历年的全球销售额

从图2可以看出，虽然噻托溴铵的销售额在2014年达其峰值（54.56亿美元）之后，由于仿制药的不断涌入，而导致其销售额逐年走低，但2017年的销售额仍然保持在46.33亿美元。

罗氟司特市场扩张的另一个不利因素来自于其薄弱的专利保护。虽然罗氟司特在美国的化合物专利US5712298借助于美国的药品专利期延长制度，有效期一致截至2020年1月，但该专利在全球其他国家或地区均在2013~2014年间失效，从而导致部分国家已经出现了仿制品。而在美国的专利期也为所剩无几，使得罗氟司特的市场表现有重大起色的希望变得非常渺茫。

3 罗氟司特的临床应用情况

虽然罗氟司特上市后的市场表现令人失望，但其临床应用价值仍然有很多可圈可点之处，特别是英国国家卫生与临床优化研究院（NICE）早在2012年1月就推荐罗氟司特用于重症COPD的治疗，又在2017年7月推荐该药用于所有严重程度的COPD的治疗，这是对罗氟司特治疗这一适应症时良好成本效益特征的充分肯定。

Kiff C发表于Int J Chron Obstruct Pulmon Dis.杂志2018年9月刊的一项成本-效益分析研究认为，与单独的三重吸入疗法（吸入糖皮质激素+长效毒蕈碱拮抗剂+长效β2受体激动剂）相比，在其基础上添加罗氟司特能非显著性地降低重症COPD患者中度与重度发作的频率，将罗氟司特添加到三重吸入疗法的增量成本效果比（ICER）为2.4976万英镑。对于先前有过住院经历的患者而言，罗氟司特能非显著性地降低中度发作的频次，并显著地降低重度发作的频次，这一人群中的ICER为7087英镑。基于此，作者认为，对于患有重度或极重度COPD、慢性支气管炎及有过发作史的患者而言，罗氟司特是一种具有良好成本-效益特征的治疗方法，将其添加到三重吸入疗法后可满足这一人群中先前未被满足的临床需求。值得注意的是，这一研究系在NICE制定的框架内进行。

4 国内注册与临床试验概况

罗氟司特由于其中国化合物专利CN94192659.1在2014年7月届满，而曾经一度成为重复申报最严重的品种之一。根据药智数据，共有70家国内企业获得了罗氟司特片与/或原料药的临床试验许可，但截止2018年10月中旬，仅有正大天晴等少数几家企业公示了罗氟司特的临床试验信息（如图3所示）

图3罗氟司特国内临床试验公示信息

5 罗氟司特最新的临床与非临床研究进展

5.1 临床研究进展

韩国研究人员Joo H等人发表于Tuberc Respir Dis (Seoul).杂志的一项观察性研究纳入了269名分别用罗氟司特500μg（N=178）与罗氟司特250μg（N=91）治疗的门诊COPD患者。罗氟司特500μg组与250μg组的不良反应发生率分别为38.2%与25.3%（P=0.034），两组的停药率分别为41.6%与23.1%（P=0.003）。根据年龄、性别、吸烟状态与肺功能进行调整后，500μg剂量下的停药率显著高于250μg（OR=2.87，P<0.001）。

Rabe KF等人发表于Lancet Respir Med.的一项跨国、多中心、随机化、双盲、安慰剂对照临床试验（ROBERT试验）考察了罗氟司特500μg qd对重症COPD与慢性支气管炎患者支气管炎症的抗炎作用。该项研究共纳入了158名伴有慢性排痰性咳嗽的重症COPD患者。分别连续治疗16周后，罗氟司特组与安慰剂组受试者支气管黏膜下层CD8细胞数量的变化情况的差异无统计学显著性（治疗比 1·03 [95% CI 0·82-1·30]; p=0·79）。但与安慰剂相比，罗氟司特500μg却可显著降低16周时支气管活体样品内的嗜酸粒细胞数量（治疗比 0·53 [95% CI 0·34-0·82]; p=0·0046）。此外，罗氟司特组受试者诱导痰液内绝对（P=0.0045）与分化（P=0.0086）嗜酸性粒细胞计数均显著低于安慰剂组。罗氟司特组与安慰剂组最常见（比如发生率>5%）的中度不良反应包括COPD恶化（4% vs 9%）、咳嗽（8% vs 5%）、腹泻（5% vs 4%）与鼻咽炎（4% vs 6%）。重度（severe）不良反应包括COPD恶化（5% vs 3%）。两组均无死亡病例，而两组的严重不良反应发生率分别为10%与6%。值得注意的是，该项研究获得了武田与阿斯利康的资助。

OPTIMIZE试验是一项旨在考察不同的给药方案对罗氟司特不良反应的影响的多中心、随机化、双盲、安慰剂对照的临床试验。Watz H等人发表在Int J Chron Obstruct Pulmon Dis.文章报道称，OPTIMIZE试验中，1321名重症COPD患者以1:1:1的比例随机分为三组，分别组每天一次罗氟司特250μg（250μg OD）、每隔一天一次罗氟司特500μg（500μg EOD）与每天一次罗氟司特（500μg OD）连续治疗4周，各组再用每天一次罗氟司特500μg联合标准疗法治疗8周。结果发现，250μg OD→500μg OD治疗组的停药率显著低于500μg OD→500μg OD组（优势比[OR]为0.66 [95% CI 0.47-0.93], p=0.017），而前者包括腹泻、恶心、头痛、食欲下降、失眠与腹痛在内的值得关注的不良反应发生率亦显著低于后者（OR值为0.63 [95% CI 0.47-0.83], p=0.001）。虽然500μg EOD→500μg OD组停药率与值得关注的不良反应的发生率均在数值上低于500μg OD→500μg OD，两其差异均无统计学显著性。

Facius A等人发表于Clin Pharmacokinet的一篇药代动力学研究则进一步阐释了OPTIMIZE试验中的药代动力学结果与药代/药效学模型特征。Facius A的研究共纳入了1238名患者的药代动力学数据，结果发现，值得关注的不良反应的发生率随着体内磷酸二酯酶Ⅳ抑制水平的上升而上升（回归方程斜率为0.484，CI：0.262~0.706，P=2×10-5）。根据PK/事件发生时间模型分析的预测，采用250μg增量滴定的受试者的停药率显著低于500μg每天一次或每隔一天一次的受试者，而其至停药时间也显著长于后两者（P=0.0014）。

Martinez FJ等人发表在Am J Respir Crit Care Med.的文章对罗氟司特的两项多中心、随机化、双盲、安慰剂对照临床试验-REACT (NCT01329029) and RE2SPOND (NCT01443845)-进行了pooled分析。在整体的ITT人群中（n=4287），罗氟司特组中至重度发作次数与重度发作次数分别较安慰剂组降低12.3%（率比： 0.88 [95% CI: 0.80-0.97], p=0.0086）与16.1（率比：0.84 [95%CI：0.71-0.99], p=0.0409）。若受试者在前一内有过因为发作而住院治疗的经历，或前一年内有过两次以上的发作，或基线嗜酸性粒细胞数量≥150×106/L或≥300×106/L，则罗氟司特降低中至重度发作的效果最为显著，四种情况的率比依次为0.74(95%CI：0.63-0.88， p=0.0005) 、0.79(95%：0.65- 0.96, p=0.0160) 、0.81 (95%：0.71-0.93，p=0.0020) 与0.77(95%：0.61- 0.97，p=0.0264)。重度发作的降低也观察到的类似的情况。对于先前有过住院经历而且基线嗜酸性粒细胞数量≥150×106/L或≥300×106/L的受试者而言，罗氟司特组的中至重度发作率分别较安慰剂组降低34.5% (率比：0.65 [95%CI：0.52-0.82], p=0.0003)与42.7% (率比：0.57 [95%CI：0.37-0.88], p=0.0111)。

Kardos P等人在Int J Chron Obstruct Pulmon Dis.杂志发表了两项前瞻性、非干预性研究（DINO与DACOTA）的结果。此两项研究旨在评价罗氟司特500μg添加疗法治疗6个月对COPD患者健康状态与生物质量的影响，分别有5462名与3645名受试者报名参加，其中3274名与916名受试者分别完成了DINO与DACOTA试验。几乎所有受试者都患有极严重的气道阻塞，DINO与DACOTA试验基线处临床COPD问卷（CCQ）的平均总分分别为3.9分与3.7分。整体而言，DACOTA与DINO试验中的提前停药率分别为33.8%与30.6%。而项试验的CCQ评分均较基线有显著性与临床相关性改善（DINO与DACOTA分别较基线平均变化1.36与0.91，两者都P<0.001）。治疗6个月后，COPD评估测试（CAT）得分的变化说明受试者的COPD症状从重度（21~30分）损伤降低至了中度损伤（11~20分）。DACOTA试验中，使用呼吸扩张剂后的FEV1平均增加了202mL（P<0.001）。两项研究中最常见的不良反应包括腹泻、恶心与体重减轻。

Rogliani P等人发表在Pulm Pharmacol Ther.的一项先导性临床试验评价了16名重度COPD患者在格隆溴铵治疗2周后添加罗氟司特（N=8）或环索奈德（N=8）治疗8周后对其肺容量与运动耐受性的影响。虽然添加治疗8周后，最低FEV1值与使用支气管扩张剂后的FEV1值均有所增加，但增加幅度较小，因此不具有显著性。此外，在格隆溴铵的基础上添加罗氟司特或环索奈德均不能改善受试者的IC与步行距离。

我国延安人民医院的研究人员发表在Medicine (Baltimore).的一项研究评价了罗氟司特对中国COPD患者的有效性与安全性。该项研究纳入了120名COPD患者，以1:1的比例随机分为两组，分别用每天一次罗氟司特500μg或安慰剂治疗12周后，与安慰剂相比，罗氟司特能显著改善受试者FEV1（P<0.01）、FVC（用力肺活量P<0.01）、FEF25-75%（25%-75%肺活量的呼气流速P<0.01）与SGRQ（圣乔治呼吸问卷得分P<0.01）较基线的变化情况。但罗氟司特组的不良反应发生率也高于安慰剂组，主要的不良反应包括上呼吸道感染（21.7% vs 11.7%）、腹泻（13.3% vs 10.0%）、厌食（8.3% vs 6.7%）等。

5.2 荟萃分析

Shen LF等人发表于Ir J Med Sci.的文章对罗氟司特治疗COPD的有效性与安全性进行了荟萃分析，该项分析纳入了11项随机化对照研究，其结果发现，与安慰剂相比，罗氟司特能显著改善使用支气管扩张剂前的FEV1（用力呼吸量，标准化差异为0.621 ± 0.161; 95% CI 0.306~0.936, p < 0.001）与使用支气管扩张剂后的FEV1（标准化差异为0.563 ± 0.149, 95% CI 0.270~0.855, p < 0.001）。此外，罗氟司特还较安慰剂更有利于降低COPD的发作次数（标准化差异为0.099 ± 0.020, 95% CI 0.061~0.138; p < 0.001）与受抑制气道炎症（suppressed airway inflammation，标准化差异为1.354 ± 0.260, 95% CI 0.845~1.862, p < 0.001）。然而与此同时，罗氟司特组的不良反应发生率也高于安慰剂组，其中腹泻与减重不良反应的率比分别为2.945（95% CI 2.453~3.536, p < 0.001）与3.814（95% CI 3.091~4.707, p < 0.001）。

5.3 临床前研究

我国南方医科大学的研究人员发表于Cell Proliferation 杂志的一项细胞研究证实，作为一种磷酸二酯酶Ⅳ抑制剂，罗氟司特与顺铂联合用药后能抑制卵巢癌OVCAR3与SKOV3细胞的细胞增殖，诱导其细胞凋亡，并将其细胞周期滞留于G0/G1期。罗氟司特还能诱导卵巢FtMt的表达、cAMP与PKA的表达，以及CREB的磷酸化反应，而上述作用可被H89所抑制。如果下调CREB则可抑制罗氟司特增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性的效果，同时抑制罗氟司特诱导的FtMt表达与CREB磷酸化反应。此外，罗氟司特还可逆转顺铂耐药性卵巢癌细胞株对顺铂的耐药性，并诱导其中的FtMt表达与cAMP/PKA/CREB活化反应，同样的，用H89处理或下调CREB均可抑制罗氟司特所诱导的上述变化。体内研究显示，罗氟司特能抑制动物模型中SKOV-3或其顺铂耐药株的进展。

动物模型研究显示，大脑内的磷酸二酯酶Ⅳ（PDE4）被抑制后可改善动物的认知功能，Takano A等人发表于Mol Imaging Biol.的一项研究采用正电子成像术（PET）考察了罗氟司特以3.6μg~200μg/kg的剂量静脉注射后对恒河猴脑部PDE4的占领率。其结果发现，PDE4占领率的增加显示出剂量依赖性与血浆浓度依赖，然而即使在最大的给药剂量（200μg/kg）下，罗氟司特对脑部PDE4的占领率也低于50%。

Santiago A等人发表于Neuropharmacology的文章将大鼠用慢性脑低灌注处理之后腹腔内注射罗氟司特0.003与0.01mg/kg，每天一次，连续29天。研究人员在CCH后的第7、14与21天采用厌恶径向迷宫法（AvRM）评价了动物的记忆功能，并采用Nissl 与Kluver-Barrera染色法分别考察了罗氟司特对海马神经退化与白质损伤的影响。结果发现，反复用罗氟司特处理能恢复CCH所诱导的认知功能损伤，但无法逆转海马神经退化。在用罗氟司特处理的大鼠的视束内白质损伤也有所缓解。体外研究显示，罗氟司特能升高含髓鞘的原发性小胶质细胞内Arg-1基因表达水平。

El-Ashmawy NE等人发表于Int Immunopharmacol.的一项研究考察了罗氟司特对右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的大鼠溃疡性结肠炎（UC）模型的抗炎作用，并探讨了可能的分子机制。结果发现，罗氟司特能延长所述UC模型的结肠长度，预防体重减轻，并改善结肠的组织学评分，从而能缓解结肠炎的严重程度。此外，罗氟司特还能通过降低结肠内的TNF-α浓度、NO与MPO活性，并下调下调iNOS基因的表达水平，从而抑制UC模型中的炎症性应答。罗氟司特处理组的cAMP水平也显著低于空白对照组。

Peng S等人发表于Cell Physiol Biochem.的一项研究将分离自大鼠的海马神经元分别用七氟烷或七氟烷+罗氟司特处理，从而考察罗氟司特对海马神经元的保护作用。结果发现，罗氟司特能促进cAMP的释放，并下调PDE-4的蛋白表达。罗氟司特单独处理（1μg）不影响海马神经元的活力与凋亡水平，但却能升高七氟烷处理的神经元的细胞活力，并降低其凋亡水平。此外，罗氟司特还能使被七氟烷所灭活的MEK/ERK通路得以恢复。

289目录药品一致性评价节点即将来临，据药智数据，289目录药品共计有国产药品批文17,688条，其中被纳入医保甲类的药品共计248个，其批准文号有16,367条，占总批文数量的92.53%，可见大量批文都在医保甲类药品中。目前一致性评价整体通过率并不高，而289目录药品目前只通过了19个品种，可以说是前路漫漫。今日，我们简单来看看289目录中的一角，窥探其进展态势。在目前的市场上，抗肿瘤、心血管、糖尿病领域中的药品一直备受关注，如今纳入甲类医保的这些药品一致性评价进展如何？若没有通过，这些便（biàn）宜的医保药品将会何去何从？

抗肿瘤和免疫机能调节药

抗肿瘤和免疫机能调节药分为3个类别：抗肿瘤药、免疫抑制剂、内分泌疗法。其289目录中的相关药品具体情况如下：

抗肿瘤药（7药品）：2药品参比备案，1药品可豁免餐后BE

据药智数据，289目录中，有7个列入2017国家医保甲类的抗肿瘤药，根据目前一致性评价进展情况，可以查询到仅有环磷酰胺片、羟基脲片2个药品有参比备案记录，其他药品均未查到相关记录。

数据来源：药智数据

免疫抑制剂（4药品）：1药品申报，1药品BE备案，4药品参比备案

289目录中，有4个列入2017国家医保甲类的免疫抑制剂药品，其中有1个药品进行了申报，1个药品进行了BE备案，4药品均进行了参比备案。

进行申报的药品为环孢素软胶囊，其国产批文有21条，涉及11家企业，申报一致性评价的企业为杭州中美华东制药有限公司，共计2个受理号，分别于6月11日、6月14日获CDE承办，目前还未启动审评，据药智注册时光轴，该药获批还有一定时间，2018年底完成可能性较低。

数据来源：药智药品注册与受理数据库

数据来源：药智数据

内分泌疗法（6药品）：2药品申报，2药品BE备案，5药品参比备案

289目录中，有6个列入2017国家医保甲类的内分泌疗法药品，其中2药品进行了申报，2药品进行了BE备案，5药品进行了参比备案，仅醋酸甲地孕酮片无相关信息。

进行申报的药品为枸橼酸他莫昔芬片、炔雌醇片。扬子江药业的枸橼酸他莫昔芬片是按照一致性评价进行的申报，8月6日进入CDE，目前还未开始审评。南通联亚药业有限公司的炔雌醇片以“同一生产线生产，2013年美国上市”为由纳入第30批优先审评，在国内进行仿制药上市申报，目前已经于5月25进入了审评序列，序列号299，若通过则视同通过一致性评价。具体情况如下表所示：

数据来源：药智数据

从抗肿瘤相关药品整体情况来看，17个药品中，进行申报的仅有3个药品，申报率较低。另有9个药品仅有参比备案信息，5个药品无一致性评价相关信息。可以看到这17个药品一致性评价情况不容乐观，已经到了最后2个月，目前进展寥寥，前路堪忧。若未在年底通过，其市场将会面临怎样的情况，会否有通融的空间，都有待后续政策的指明方向。

糖尿病用药

在糖尿病用药中，289目录列入2017版国家医保甲类的药品有10个，具体进展情况如下：

10药品：2药品获批，5药品申报，5药品BE备案，10药品参比备案

糖尿病领域的10个药品中，有2个药品已经有企业获批，分别为格列美脲片（5家企业申报，扬子江药业获批）、盐酸二甲双胍片（6家企业申报，北京四环制药、石药欧意获批）；另外还有阿卡波糖胶囊、阿卡波糖片、格列吡嗪片均有1家企业进行了申报。具体情况如下表：

数据来源：药智数据

10个糖尿病药品中，仅通过2个，另外还有3个有企业申报，但是目前离审批结束还有一定时间，进展缓慢。另有5个药品仅有参比备案的信息，还未进行申报，其最终结局还不明朗。

心血管系统用药

在心血管系统药品中，289目录里列入2017版国家医保甲类的药品有32个，具体进展情况如下：

32药品：4药品获批，8药品申报，14药品BE备案，31药品参比备案

心血管系统的32个药品中，目前有4个药品获批，分别为苯磺酸氨氯地平片（14家企业申报，3企业获批：江苏黄河药业、扬子江药业集团、华润赛科药业）、富马酸比索洛尔片（2家企业申报，成都苑东生物制药获批）、卡托普利片（3家企业申报，2企业获批：常州制药厂、石药欧意）、马来酸依那普利片（2家企业申报、扬子江药业集团获批）

进行申报的药品还有，氢氯噻嗪片（1企业申报）、辛伐他汀片（1企业申报）、盐酸普萘洛尔片（1企业申报）、吲达帕胺片（6企业申报）。具体情况如下表：

数据来源：药智数据

心血管系统用药是当下国内用药量很大的一个领域，而在医保甲类的32个药品中，目前获批率才12.5%，申报率25%。还有24个药品未申报，将面临未知的结局，若被淘汰，对于患者来说，将失去便（biàn）宜的条件。而对于企业来说，失去这片较大的医保药市场，也有一定的损失。

注：数据与信息为手动筛选及整理，若有遗漏，欢迎留言补充！

数据来源：药智数据